Rapport d’analyse Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020 version traduite

Ils sont chercheurs, généticien, virologues, biologistes, biolchimistes, affiliés à la médecine classique et aux labos pharma. Ils ne sont pas suspects de complotistes et ne sont pas des « charlatans ».

Le lien vers l’article complet en Anglais https://cormandrostenreview.com/report/

Traduit avec Deepl

Rapport d’analyse Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020

27 novembre 2020

Ce rapport d’évaluation détaillé a été officiellement soumis au comité de rédaction d’Eurosurveillance le 27 novembre 2020 via leur portail de soumission. Une lettre de demande de rétractation, signée par tous les auteurs principaux et co-auteurs, est jointe au présent rapport d’évaluation. Les noms et prénoms indiqués sont ceux des premier et deuxième auteurs principaux. Tous les noms entre les deux sont des co-auteurs.

L’examen externe par les pairs du test RTPCR pour la détection du SRAS-CoV-2 révèle 10 failles scientifiques majeures au niveau moléculaire et méthodologique : conséquences en cas de résultats faussement positifs.

Pieter Borger(1), Bobby Rajesh Malhotra(2) , Michael Yeadon(3) , Clare Craig(4), Kevin McKernan(5) , Klaus Steger(6) , Paul McSheehy(7) , Lidiya Angelova(8), Fabio Franchi(9), Thomas Binder(10), Henrik Ullrich(11) , Makoto Ohashi(12), Stefano Scoglio(13), Marjolein Doesburg-van Kleffens(14), Dorothea Gilbert(15), Rainer Klement(16), Ruth Schruefer(17), Berber W. Pieksma(18), Jan Bonte(19), Bruno H. Dalle Carbonare(20), Kevin P. Corbett(21), Ulrike Kämmerer(22)

ABSTRACT

Dans la publication intitulée « Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR » (Eurosurveillance 25(8) 2020), les auteurs présentent un flux de travail diagnostique et un protocole RT-qPCR pour la détection et le diagnostic du 2019-nCoV (maintenant connu sous le nom de SARS-CoV-2), qu’ils affirment avoir validé, ainsi qu’une méthodologie de diagnostic robuste pour une utilisation dans les laboratoires de santé publique.

Compte tenu de toutes les conséquences de cette même publication pour les sociétés du monde entier, un groupe de chercheurs indépendants a réalisé un examen point par point de ladite publication dans lequel 1) tous les éléments de la conception du test présenté ont été vérifiés, 2) les recommandations du protocole RT-qPCR ont été évaluées par rapport aux bonnes pratiques de laboratoire et 3) les paramètres ont été examinés par rapport à la littérature scientifique pertinente couvrant le domaine.

Le protocole RT-qPCR publié pour la détection et le diagnostic du 2019-nCoV et le manuscrit souffrent de nombreuses erreurs techniques et scientifiques, notamment une conception d’amorce insuffisante, un protocole RT-qPCR problématique et insuffisant, et l’absence d’une validation précise du test. Ni le test présenté ni le manuscrit lui-même ne remplissent les conditions d’une publication scientifique acceptable. En outre, de graves conflits d’intérêts des auteurs ne sont pas mentionnés. Enfin, le délai très court entre la soumission et l’acceptation de la publication (24 heures) signifie qu’un processus systématique d’examen par les pairs n’a pas été effectué ici, ou qu’il est de mauvaise qualité.  Nous fournissons des preuves irréfutables de plusieurs insuffisances, erreurs et défauts scientifiques.

Compte tenu des défauts scientifiques et méthodologiques présentés ici, nous sommes convaincus que le comité de rédaction d’Eurosurveillance n’a pas d’autre choix que de retirer la publication.

RAPPORT D’EXAMEN CONCIS

Cet article montrera les nombreuses et graves lacunes de l’article de Corman-Drosten, dont l’importance a conduit à un mauvais diagnostic mondial des infections attribuées au SRAS-CoV-2 et associées à la maladie COVID-19. Nous sommes confrontés à un verrouillage strict qui a détruit la vie et les moyens de subsistance de nombreuses personnes, à un accès limité à l’éducation et ces restrictions imposées par les gouvernements du monde entier constituent une attaque directe contre les droits fondamentaux des personnes et leurs libertés individuelles, ce qui entraîne des dommages collatéraux pour des économies entières à l’échelle mondiale.

Le document de Corman-Drosten comporte dix problèmes majeurs que nous allons décrire et expliquer plus en détail dans les sections suivantes.

Le premier et principal problème est que le nouveau Coronavirus SARS-CoV-2 (dans la publication nommée 2019-nCoV et en février 2020 nommée SARS-CoV-2 par un consortium international d’experts en virus) est basé sur des séquences in silico (théoriques), fournies par un laboratoire en Chine [1], car à l’époque ni le matériel de contrôle du SARS-CoV-2 infectieux « vivant » ou inactivé ni l’ARN génomique isolé du virus n’étaient disponibles pour les auteurs. À ce jour, aucune validation n’a été effectuée par l’auteur sur la base de virus isolés du SRAS-CoV-2 ou de leur ARN complet. Selon Corman et al : « Nous avions pour objectif de développer et de déployer une méthodologie de diagnostic robuste pour une utilisation dans les laboratoires de santé publique sans avoir de matériel viral disponible. » [1]   .   L’accent doit être mis ici sur les deux objectifs déclarés : a) le développement et b) le déploiement d’un test de diagnostic destiné à être utilisé dans les laboratoires de santé publique. Ces objectifs ne peuvent être atteints sans disposer d’un matériel viral réel (par exemple pour déterminer la charge virale infectieuse). En tout état de cause, seul un protocole d’une précision maximale peut être l’objectif obligatoire et principal dans tout scénario – résultat de cette ampleur. La détermination de la charge virale critique est une information obligatoire, et il est de la responsabilité du groupe de Christian Drosten de réaliser ces expériences et de fournir les données cruciales. Néanmoins, ces séquences in silico ont été utilisées pour développer une méthodologie de test RT-PCR afin d’identifier ledit virus. Ce modèle était basé sur l’hypothèse que le nouveau virus est très similaire au SRAS-CoV de 2003 car les deux sont des bêta-coronavirus.

Le test PCR a donc été conçu en utilisant la séquence génomique du CoV-SARS comme matériel de contrôle pour le composant Sarbeco ; nous le savons grâce à notre communication personnelle par courrier électronique avec [2] l’un des co-auteurs de l’article de Corman-Drosten. Cette méthode de modélisation du CoV-SARS-2 a été décrite comme suit dans l’article de Corman-Drosten : « l’établissement et la validation d’un flux de travail diagnostique pour le dépistage et la confirmation spécifique du CoV 2019, conçu en l’absence d’isolats de virus disponibles ou d’échantillons originaux de patients. La conception et la validation ont été rendues possibles grâce à la relation génétique étroite avec le CoV-SARS de 2003, et grâce à l’utilisation de la technologie des acides nucléiques synthétiques ».

L’amplification en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR) est une technologie biomoléculaire importante qui permet de détecter rapidement des fragments d’ARN rares, connus à l’avance. Dans un premier temps, les molécules d’ARN présentes dans l’échantillon sont transcrites de manière inverse pour produire de l’ADNc. L’ADNc est ensuite amplifié dans la réaction en chaîne de la polymérase en utilisant une paire d’amorces spécifiques et une enzyme thermostable, l’ADN polymérase. Cette technologie est très sensible et sa limite de détection est théoriquement de 1 molécule d’ADNc. La spécificité de la PCR est fortement influencée par des erreurs de conception biomoléculaire.

Qu’est-ce qui est important lors de la conception d’un test RT-PCR et du test RT-qPCR quantitatif décrit dans la publication de Corman-Drosten ?

1. Les amorces et les sondes :

a) la concentration des amorces et des sondes doit être optimale (100-200 nM)

b) doit être spécifique au gène cible que vous voulez amplifier

c) doit avoir un pourcentage optimal de teneur en GC par rapport aux bases azotées totales (minimum 40 %, maximum 60 %)

d) pour le diagnostic des virus, au moins 3 paires d’amorces doivent permettre de détecter 3 gènes viraux (de préférence aussi éloignés que possible dans le génome viral)

2. La température à laquelle toutes les réactions ont lieu :

a) Température de fusion de l’ADN (>92°)

b) Température d’amplification de l’ADN (spécifique TaqPol)

c) Tm ; la température de recuit (la température à laquelle les amorces et les sondes atteignent la liaison/détachement cible, ne devant pas dépasser 2 ̊C par paire d’amorces). La Tm dépend fortement de la teneur en GC des amorces

3. Le nombre de cycles d’amplification (moins de 35 ; de préférence 25-30 cycles) ;

En cas de détection du virus, >35 cycles ne détecte que les signaux qui ne sont pas en corrélation avec le virus infectieux tel que déterminé par l’isolement en culture cellulaire [voir point 2] ; si une personne est testée par PCR comme étant positive lorsqu’un seuil de 35 cycles ou plus est utilisé (comme c’est le cas dans la plupart des laboratoires en Europe et aux États-Unis), la probabilité que ladite personne soit réellement infectée est inférieure à 3 %, la probabilité que ledit résultat soit un faux positif est de 97 % [voir point 3].

4. Validations biologiques moléculaires ; les produits de la PCR amplifiée doivent être validés soit en faisant passer les produits dans un gel avec une règle à ADN, soit par séquençage direct de l’ADN

5. Les contrôles positifs et négatifs doivent être spécifiés pour confirmer/refuser la détection d’un virus spécifique

6. Il devrait y avoir une procédure opérationnelle standard (POS) disponible

Les procédures d’exploitation standard spécifient sans équivoque les paramètres ci-dessus, de sorte que tous les laboratoires sont en mesure de mettre en place exactement les mêmes conditions d’essai. Il est essentiel de disposer d’une procédure d’utilisation universelle validée, car elle permet de comparer les données au sein des pays et entre eux.

PRÉOCCUPATIONS MINEURES CONCERNANT LE PAPIER CORMAN-DROSTEN

1. Dans le tableau 1 du document de Corman-Drosten, différentes abréviations sont indiquées – « nM » est spécifié, « nm » ne l’est pas. En ce qui concerne la nomenclature, nm signifie « nanomètre », donc nm doit se lire nM ici.

2. Il est généralement admis que les séquences génétiques doivent toujours être écrites dans le sens 5′-3′, y compris les amorces inverses. Il est très inhabituel de faire un alignement avec l’écriture complémentaire inverse de la séquence d’amorces comme l’ont fait les auteurs dans la figure 2 de l’article de Corman-Drosten. Ici, en outre, une base ondulante est marquée comme « y » sans description des bases que représente le Y.

3. L’article de Corman-Drosten présente deux pièges trompeurs : le tableau 1 n’inclut pas les valeurs Tm (valeurs de la température de recuit), ni les valeurs GC (nombre de G et C dans les séquences en % de la valeur totale des bases).

PRINCIPALES PRÉOCCUPATIONS CONCERNANT LE PAPIER CORMAN-DROSTEN

A) CONTEXTE

Les auteurs présentent le contexte de leur travail scientifique comme : « L’épidémie actuelle du nouveau coronavirus (2019-nCoV) récemment apparu pose un défi aux laboratoires de santé publique car les isolats du virus ne sont pas disponibles alors qu’il est de plus en plus évident que l’épidémie est plus étendue qu’on ne le pensait initialement et que la propagation internationale par les voyageurs se produit déjà ».

Selon BBC News [4] et Google Statistics [5], il y a eu 6 décès dans le monde le 21 janvier 2020, jour où le manuscrit a été soumis. Pourquoi les auteurs ont-ils supposé un défi pour les laboratoires de santé publique alors qu’il n’y avait pas de preuves substantielles à ce moment-là pour indiquer que l’épidémie était plus répandue qu’on ne le pensait initialement ?

Les auteurs ont déclaré avoir pour objectif de développer et de déployer une méthodologie de diagnostic robuste à utiliser dans les laboratoires de santé publique sans disposer de matériel viral. En outre, ils reconnaissent que « la présente étude démontre l’énorme capacité de réaction obtenue grâce à la coordination des laboratoires universitaires et publics dans les réseaux de recherche nationaux et européens ».

B) MÉTHODES ET RÉSULTATS

1. Conception de l’amorce et de la sonde

1a) Concentrations d’amorce erronées

Des protocoles de test PCR fiables et précis sont normalement conçus en utilisant entre 100 nM et 200 nM par amorce [7]. Dans l’article de Corman-Drosten, nous observons des concentrations d’amorces exceptionnellement élevées et variables pour plusieurs amorces (tableau 1). Pour les paires d’amorces RdRp_SARSr-F et RdRp_SARSr-R, 600 nM et 800 nM sont décrites, respectivement. De même, pour l’ensemble d’amorces N_Sarbeco_F et N_Sarbeco_R, ils conseillent respectivement 600 nM et 800 nM [1].

Il devrait être clair que ces concentrations sont beaucoup trop élevées pour être optimales pour des amplifications spécifiques de gènes cibles. Il n’y a aucune raison précise d’utiliser ces concentrations extrêmement élevées d’amorces dans ce protocole. Au contraire, ces concentrations entraînent une augmentation de la liaison non spécifique et de l’amplification des produits de la PCR.

Tableau 1 : Amorces et sondes (adapté du papier Corman-Drosten ; les concentrations d’amorces erronées sont mises en évidence)

1b) Séquences d’amorces et de sondes non spécifiées (« Wobbly »)

Pour obtenir des résultats reproductibles et comparables, il est essentiel de définir distinctement les paires d’amorces. Dans le document de Corman-Drosten, nous avons observé six positions non spécifiées, indiquées par les lettres R, W, M et S (tableau 2). La lettre W signifie qu’à cette position il peut y avoir soit un A soit un T ; R signifie qu’il peut y avoir soit un G soit un A ; M indique que la position peut être soit un A soit un C ; la lettre S indique qu’il peut y avoir soit un G soit un C sur cette position.

Ce nombre élevé de variantes est non seulement inhabituel, mais il est également très déroutant pour les laboratoires. Ces six positions non spécifiées pourraient facilement donner lieu à la conception de plusieurs séquences d’amorces alternatives différentes qui ne sont pas liées au SARS-CoV-2 (2 amorces RdRp_SARSr_F distinctes + 8 sondes RdRp_SARS_P1 distinctes + 4 RdRp_SARSr_R distinctes). Les variations de conception conduiront inévitablement à des résultats qui ne sont même pas liés à la CoV-2 du SRAS. Par conséquent, la description confuse et non spécifique du document Corman-Drosten ne convient pas comme protocole opérationnel standard. Ces positions non spécifiées auraient dû être conçues sans équivoque.

Ces séquences bancales ont déjà créé une source d’inquiétude sur le terrain et ont donné lieu à une lettre à la rédaction rédigée par Pillonel et al [8] concernant des erreurs flagrantes dans les séquences décrites. Ces erreurs sont également évidentes dans le supplément de Corman et al.

Tableau 2 : Amorces et sondes (adapté de l’article de Corman-Drosten ; les nucléotides non spécifiés (« Wobbly ») dans les amorces sont mis en évidence)

Le protocole de l’OMS (figure 1), qui découle directement de l’article de Corman-Drosten, conclut que pour confirmer la présence du CoV-2 du SRAS, deux gènes de contrôle (les gènes E et RdRp) doivent être identifiés dans le test. Il convient de noter que le gène RdPd- a une position incertaine (« bancale ») dans l’amorce avant (R=G/A), deux positions incertaines dans l’amorce arrière (R=G/A ; S=G/C) et trois positions incertaines dans la sonde RdRp (W=A/T ; R=G/A ; M=A/C). Ainsi, deux amorces avant différentes, quatre amorces arrière différentes et huit sondes distinctes peuvent être synthétisées pour le gène RdPd-. Au total, il y a 64 combinaisons possibles d’amorces et de sondes !

Le document de Corman-Drosten identifie en outre un troisième gène qui, selon le protocole de l’OMS, n’a pas été validé davantage et a été jugé invalide : « Il est à noter que le test du gène N a également donné de bons résultats mais n’a pas été soumis à une validation supplémentaire intensive car il était légèrement moins sensible ».

Il s’agit d’une omission regrettable car il aurait été préférable d’utiliser les trois PCR de gènes comme tests de confirmation, ce qui aurait permis d’obtenir un protocole d’outil de diagnostic de détection de l’ARN viral presque suffisant. Trois étapes de test de confirmation permettraient au moins de minimiser les erreurs et les incertitudes à chaque étape en ce qui concerne les points « bancals ». (Néanmoins, le protocole serait toujours en deçà de toute « bonne pratique de laboratoire », si l’on tient compte de toutes les autres erreurs de conception).

En l’état actuel, le test du gène N n’est malheureusement pas proposé dans la recommandation de l’OMS (figure 1) comme une troisième étape de confirmation obligatoire et cruciale, ni souligné dans le document Corman-Drosten comme une importante garantie optionnelle « pour un travail de routine » (tableau 2).

En conséquence, dans presque toutes les procédures de test dans le monde, seules deux amorces de concordance ont été utilisées au lieu des trois. Cet oubli rend l’ensemble du protocole de test invalide pour obtenir des résultats précis et réellement significatifs dans le cadre d’une pandémie en cours.

Figure 1 : L’essai de confirmation N-Gene n’est pas considéré comme la troisième étape nécessaire dans la recommandation officielle du protocole Drosten-Corman de l’OMS [8], ni comme une étape cruciale pour améliorer la précision des tests dans la publication d’Eurosurveillance.

1c) Teneur en GC erronée (traitée dans 2c, avec la température de recuit (Tm))

1d) Détection de gènes viraux

La RT-PCR n’est pas recommandée pour le diagnostic primaire d’une infection. C’est pourquoi le test RT-PCR utilisé en routine clinique pour la détection de COVID-19 n’est pas indiqué pour le diagnostic de COVID-19 sur une base réglementaire.

« Les cliniciens doivent reconnaître la précision et la rapidité accrues des techniques de diagnostic moléculaire pour le diagnostic des infections, mais aussi comprendre leurs limites. Les résultats de laboratoire doivent toujours être interprétés dans le contexte de la présentation clinique du patient, et un site approprié, la qualité et le moment du prélèvement des échantillons sont nécessaires pour obtenir des résultats de test fiables ». [9]

Toutefois, elle peut être utilisée pour aider le médecin à établir un diagnostic différentiel lorsqu’il doit faire la distinction entre différentes infections pulmonaires (la grippe, le Covid-19 et le SRAS présentent des symptômes très similaires). Pour un diagnostic de confirmation d’un virus spécifique, il faut appliquer au moins 3 paires d’amorces spécifiques pour détecter 3 gènes spécifiques du virus. De préférence, ces gènes cibles doivent être situés le plus loin possible dans le génome viral (extrémités opposées comprises).

Bien que l’article de Corman-Drosten décrive 3 amorces, ces amorces ne couvrent qu’environ la moitié du génome du virus. C’est un autre facteur qui diminue la spécificité pour la détection de l’ARN intact du virus COVID-19 et qui augmente la citation des résultats faux positifs des tests.

Par conséquent, même si nous obtenons trois signaux positifs (c’est-à-dire que les trois paires d’amorces donnent 3 produits d’amplification différents) dans un échantillon, cela ne prouve pas la présence d’un virus. Une meilleure conception des amorces permettrait d’avoir des amorces terminales aux deux extrémités du génome viral. En effet, l’ensemble du génome viral serait couvert et trois signaux positifs permettraient de mieux distinguer un virus complet (et donc potentiellement infectieux) des génomes viraux fragmentés (sans pouvoir infectieux). Afin de pouvoir déduire quoi que ce soit d’important sur l’infectivité du virus, le gène Orf1, qui code l’enzyme réplicase essentielle des virus du SRAS-CoV, aurait dû être inclus comme cible (figure 2). Le positionnement des cibles dans la région du génome viral la plus fortement et variablement transcrite est une autre faiblesse du protocole.

Kim et al. démontrent une expression 3′ très variable de l’ARN subgénomique dans le Sars-CoV-2 [23]. Ces ARN sont activement surveillés en tant que signatures pour les patients asymptomatiques et non infectieux [10]. Il est très discutable de cribler une population de personnes asymptomatiques avec des amorces de RCPQ qui ont 6 paires de bases amorces-dimères sur les 3 extrémités principales d’une amorce (Figure 3).

Apparemment, l’OMS recommande ces amorces. Nous avons testé tous les dérivés de wobble du papier Corman-Drosten avec l’outil web de Thermofisher pour le dimère d’amorce [11]. L’amorce RdRp forward a une homologie de 6bp 3prime avec Sarbeco E Reverse. À de fortes concentrations d’amorce, cela suffit à créer des inexactitudes.

À noter : il existe une correspondance parfaite entre l’une des amorces N et un pathogène clinique (Pantoea), trouvé chez des patients immunodéprimés. L’amorce inverse touche également le Pantoea, mais pas dans la même région (figure 3).

Il s’agit là de graves erreurs de conception, car le test ne peut pas faire la distinction entre le virus entier et les fragments viraux. Le test ne peut pas être utilisé pour diagnostiquer les virus du SRAS.

Figure 2 : Positions relatives des cibles de l’amplicon sur le coronavirus du SRAS et le génome du nouveau coronavirus 2019. ORF : cadre de lecture ouvert ; RdRp : ARN polymérase ARN-dépendante. Les chiffres sous l’amplicon sont des positions du génome selon SARS-CoV, NC_004718 [1] ;

Figure 3 : Un test avec l’outil web de Thermofischer pour le dimmer de l’amorce révèle que l’amorce RdRp avant a une homologie 6bp 3`prime avec Sarbeco E Reverse (encadré de gauche). Un autre test révèle que l’un des amorces N correspond parfaitement à un pathogène clinique (Pantoea) trouvé chez des patients immunodéprimés (encadré de droite).

2. Températures de réaction

2a) Température de fusion de l’ADN (>92°).

Abordé de manière adéquate dans le document de Corman-Drosten.

2b) Température d’amplification de l’ADN.

Ce sujet est traité de manière appropriée dans l’article de Corman-Drosten.

2c) Teneur erronée en GC et Tm

La température de recuit détermine à quelle température l’amorce s’attache/se détache de la séquence cible. Pour une amplification efficace et spécifique, la teneur en GC des amorces doit atteindre une amplification de 40 % au minimum et de 60 % au maximum. Comme indiqué dans le tableau 3, trois des amorces décrites dans le document de Corman-Drosten ne se situent pas dans la plage normale pour la teneur en GC. Deux amorces (RdRp_SARSr_F et RdRp_SARSr_R) ont des valeurs de GC inhabituelles et très faibles de 28%-31% pour toutes les variantes possibles de bases oscillantes, tandis que l’amorce E_Sarbeco_F a une valeur de GC de 34,6% (tableau 3 et deuxième panneau du tableau 3).

Il convient de noter que la teneur en GC détermine largement la liaison à sa cible spécifique en raison de ses trois liaisons hydrogène dans l’appariement des bases. Ainsi, plus la teneur en GC de l’amorce est faible, plus sa capacité de liaison à la séquence de son gène cible spécifique (c’est-à-dire le gène à détecter) est faible. Cela signifie que pour qu’une séquence cible soit reconnue, nous devons choisir une température aussi proche que possible de la température d’hybridation réelle (valeur de meilleure pratique) pour que l’amorce ne se détache pas à nouveau, tout en sélectionnant spécifiquement la séquence cible.

Si la valeur Tm est très faible, comme on l’a observé pour toutes les variantes bancales des amorces inversées RdRp, les amorces peuvent se lier de manière non spécifique à plusieurs cibles, ce qui diminue la spécificité et augmente le risque de résultats faussement positifs.

La température de recuit (Tm) est un facteur crucial pour la détermination de la spécificité/précision de la procédure de qPCR et essentielle pour évaluer la précision des protocoles de qPCR. Recommandation de meilleures pratiques : Les deux amorces (avant et arrière) devraient avoir une valeur presque similaire, de préférence identique.

Nous avons utilisé le logiciel gratuit de conception d’amorces Primer-BLAST [12, 25] pour évaluer les valeurs des meilleures pratiques pour toutes les amorces utilisées dans l’article de Corman-Drosten (tableau 3). Nous avons tenté de trouver une valeur Tm de 60° C, tout en cherchant également la valeur GC% la plus élevée possible pour toutes les amorces. Une différence Tm maximale de 2° C au sein des paires d’amorces a été jugée acceptable. En testant les paires d’amorces spécifiées dans le document Corman-Drosten, nous avons observé une différence de 10° C par rapport à la température de recuit Tm pour la paire d’amorces1 (RdRp_SARSr_F et RdRp_SARSr_R). Il s’agit d’une erreur très grave qui rend le protocole invalide en tant qu’outil de diagnostic spécifique.

Des tests supplémentaires ont démontré que seule la paire d’amorces conçue pour amplifier le gène N (N_Sarbeco_F et N_Sarbeco_R) a atteint le standard adéquat pour fonctionner dans un test de diagnostic, puisqu’elle a un contenu GC suffisant et que la différence Tm entre les amorces (N_Sarbeco_F et N_Sarbeco_R) est de 1,85° C (en dessous du maximum crucial de 2° C de différence). Il est important de noter que ce gène n’a été ni testé dans les échantillons de virus (tableau 2) ni mis en évidence comme test de confirmation. Outre les températures de fusion très variables et les séquences dégénérées de ces amorces, un autre facteur influe sur la spécificité de la procédure : les dNTP (0,4uM) sont 2x plus élevés que ce qui est recommandé pour une amplification hautement spécifique. Du sulfate de magnésium supplémentaire est également ajouté à la réaction. Cette procédure, combinée à une température de recuit basse, peut créer des amplifications non spécifiques. Lorsqu’un supplément de magnésium est nécessaire pour la RCPQ, la spécificité du dosage doit être examinée plus en détail.

Les erreurs de conception décrites ici sont si graves qu’il est très peu probable qu’une amplification spécifique du matériel génétique du SRAS-CoV-2 se produise en utilisant le protocole de l’article de Corman-Drosten.

Tableau 3 : Contenu en GC des amorces et des sondes (adapté du document de Corman-Drosten ; les aberrations des contenus en GC optimisés sont mises en évidence. Le deuxième tableau présente une liste de toutes les valeurs des meilleures pratiques de Primer-BLAST pour toutes les amorces et sondes utilisées dans l’article de Corman-Drosten par le professeur Ulrike Kämmerer et son équipe.

3. Le nombre de cycles d’amplification

Il convient de noter que le document Corman-Drosten ne mentionne nulle part qu’un test est positif ou négatif, ni même ce qui définit un résultat positif ou négatif. Ces types de tests de diagnostic virologique doivent être basés sur une procédure opératoire normalisée, comprenant un nombre validé et fixe de cycles PCR (valeur Ct) après lesquels un échantillon est considéré comme positif ou négatif. La valeur Ct maximale raisonnablement fiable est de 30 cycles. Au-delà d’un Ct de 35 cycles, il faut s’attendre à une augmentation rapide du nombre de faux positifs.

Les données PCR évaluées comme positives après une valeur Ct de 35 cycles ne sont pas du tout fiables.

Citant Jaafar et al. 2020 [3] : « A Ct = 35, la valeur que nous avons utilisée pour rapporter un résultat positif pour la PCR, <3% des cultures sont positives. » En d’autres termes, il n’y a pas eu d’isolement réussi du virus du SRAS-CoV-2 à ces valeurs élevées de Ct.

En outre, des études scientifiques montrent que seuls les virus non infectieux (morts) sont détectés avec des valeurs de Ct de 35 [22].

Entre 30 et 35, il existe une zone grise, où un test positif ne peut être établi avec certitude. Cette zone doit être exclue. Bien sûr, on peut effectuer 45 cycles PCR, comme le recommande le protocole OMS Corman-Drosten (figure 4), mais il faut aussi définir une valeur Ct raisonnable (qui ne doit pas dépasser 30). Mais un résultat d’analyse avec une valeur Ct de 45 n’a absolument aucune signification scientifique et diagnostique (une valeur Ct raisonnable ne doit pas dépasser 30). Tout cela doit être communiqué très clairement. C’est une grave erreur que le document Corman-Drosten ne mentionne pas la valeur Ct maximale à laquelle un échantillon peut être considéré sans ambiguïté comme un résultat positif ou négatif. Cette importante limite de seuil de cycle n’est pas non plus précisée dans les communications de suivi à ce jour.

Figure 4 : Recommandation du kit RT-PCR dans le protocole officiel Corman-Drosten de l’OMS [8]. Seule une valeur « cyclique » (cycles) peut être trouvée sans Ct (valeur seuil) correspondante et scientifiquement raisonnable. Cette valeur ou toute autre valeur de cycle ne figure nulle part dans le document Corman-Drosten proprement dit.

4. Validations biomoléculaires

Pour déterminer si les produits amplifiés sont bien des gènes du SRAS-CoV-2, la validation biomoléculaire des produits PCR amplifiés est essentielle. Pour un test de diagnostic, cette validation est une critère incontournable.

La validation des produits PCR doit être effectuée soit en faisant passer le produit PCR dans un gel d’agarose-EtBr à 1% avec un indicateur de taille (règle d’ADN ou échelle d’ADN) afin de pouvoir estimer la taille du produit. La taille doit correspondre à la taille calculée du produit d’amplification. Mais il est encore mieux de séquencer le produit d’amplification. Ce dernier donnera une certitude de 100% quant à l’identité du produit d’amplification. Sans validation moléculaire, on ne peut pas être sûr de l’identité des produits PCR amplifiés. Compte tenu des graves erreurs de conception décrites précédemment, les produits PCR amplifiés peuvent être n’importe quoi.

Le document de Corman-Drosten ne mentionne pas non plus le cas des petits fragments de qPCR (environ 100 pb) : Il peut s’agir soit d’un gel d’agarose à 1,5%, soit même d’un gel d’acrylamide.

Le fait que ces produits PCR n’aient pas été validés au niveau moléculaire est une autre erreur frappante du protocole, rendant tout test basé sur celui-ci invalide comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SRAS-CoV-2.

5. Contrôles positifs et négatifs pour confirmer/refuser la détection spécifique du virus.

L’hypothèse non confirmée décrite dans le document de Corman-Drosten est que le CoV-2 du SRAS est le seul virus du groupe des bêta-coronavirus de type SRAS qui provoque actuellement des infections chez l’homme. Les séquences sur lesquelles se base la méthode PCR sont des séquences in silico, fournies par un laboratoire en Chine [23], car au moment du développement du test PCR, aucun matériel de contrôle du CoV-2-SARS infectieux (« vivant ») ou inactivé n’était disponible pour les auteurs. Le test PCR a donc été conçu en utilisant la séquence du CoV-SARS connu comme matériel de contrôle pour le composant Sarbeco (Dr Meijer, co-auteur de l’article Corman-Drosten dans un échange de courriels avec le Dr Peter Borger) [2].

Toutes les personnes dont le test RT-PCR, tel que décrit dans l’article de Corman-Drosten, s’est révélé positif sont supposées être positives pour les infections par le CoV-2 du SRAS. Cette hypothèse comporte trois graves défauts. Premièrement, un test positif pour les molécules d’ARN décrit dans l’article de Corman-Drosten ne peut être assimilé à une « infection par un virus ». Un test RT-PCR positif indique simplement la présence de molécules d’ARN viral. Comme démontré au point 1d (ci-dessus), le test de Corman-Drosten n’a pas été conçu pour détecter le virus dans sa totalité, mais seulement un fragment du virus. Nous avons déjà conclu que ce test était inadapté en tant que test de diagnostic pour les infections par le virus du SRAS.

Deuxièmement, et c’est un point très important, la fonctionnalité du test RT-PCR publié n’a pas été démontrée avec l’utilisation d’un témoin positif (ARN isolé du CoV-2 du SRAS) qui est un étalon-or scientifique essentiel.

Troisièmement, l’article de Corman-Drosten indique « Pour montrer que les tests peuvent détecter d’autres virus liés au SRAS associés aux chauves-souris, nous avons utilisé le test du gène E pour tester six échantillons de matières fécales provenant de chauves-souris disponibles auprès de Drexler et al. […] et de Muth et al. […]. Ces échantillons positifs pour le virus provenaient de chauves-souris rhinolophiles européennes. La détection de ces valeurs phylogénétiques aberrantes dans le cadre du clade CoV lié au SRAS suggère que tous les virus asiatiques sont susceptibles d’être détectés. Cela permettrait, en théorie, d’assurer une large sensibilité même en cas d’acquisitions multiples et indépendantes de variantes de virus provenant d’un réservoir animal ».

Cette déclaration démontre que le gène E utilisé dans le test RT-PCR, tel que décrit dans le document de Corman-Drosten, n’est pas spécifique au CoV-2 du SRAS.

Les amorces du gène E permettent également de détecter un large spectre d’autres virus du SRAS.

Le génome du coronavirus est le plus grand de tous les virus à ARN qui infectent les humains et ils ont tous une structure moléculaire très similaire. Néanmoins, le CoV1 et le CoV-2 du SRAS ont deux empreintes génétiques très spécifiques, qui les distinguent des autres coronavirus. Premièrement, une séquence unique d’empreintes digitales (KTFPPTEPKKDKKKK) est présente dans la protéine N du CoV-SAR et du CoV-SAR-2 [13,14,15]. Deuxièmement, le SARS-CoV1 et le SARS-CoV2 ne contiennent pas la protéine HE, alors que tous les autres coronavirus possèdent ce gène [13, 14]. Ainsi, afin de détecter spécifiquement un produit PCR du CoV1 et du CoV2 du SRAS, la région susmentionnée du gène N aurait dû être choisie comme cible d’amplification. Un test de diagnostic fiable devrait se concentrer sur cette région spécifique du gène N comme test de confirmation. La PCR pour ce gène N n’a pas été validée davantage ni recommandée comme gène test par l’article de Drosten-Corman, car elle n’est « pas aussi sensible » avec la sonde originale du CoV-SARS [1].

En outre, l’absence du gène HE dans le SARS-CoV1 et le SARS-CoV-2 fait de ce gène le témoin négatif idéal pour exclure d’autres coronavirus. Le document de Corman-Drosten ne contient pas ce contrôle négatif, ni aucun autre contrôle négatif. Le test PCR du papier Corman-Drosten ne contient donc ni témoin positif unique ni témoin négatif permettant d’exclure la présence d’autres coronavirus (les coronavirus sont une immense famille de virus, dont certains infectent différents animaux, d’autres l’Homme.  ils sont habituellement bénins, à l’origine de rhumes qui guérissent spontanément). Il s’agit là d’un autre défaut de conception majeur qui classe le test comme inadapté au diagnostic.

6. La procédure opérationnelle standard (SOP) n’est pas disponible

Une procédure opérationnelle standard (POS) devrait être disponible, qui spécifie sans équivoque les paramètres ci-dessus, afin que tous les laboratoires puissent mettre en place les mêmes conditions d’essai identiques. Il est essentiel de disposer d’une procédure opérationnelle standard universelle validée, car elle facilite la comparaison des données au sein des pays et entre eux. Il est très important de spécifier sans équivoque tous les paramètres de l’amorce. Nous constatons que cela n’a pas été fait. En outre, la valeur de Ct pour indiquer quand un échantillon doit être considéré comme positif ou négatif n’est pas spécifiée. Elle n’est pas non plus spécifiée lorsqu’un échantillon est considéré comme infecté par les virus du SRAS-CoV. Comme indiqué ci-dessus, le test ne peut pas faire la distinction entre le virus et les fragments de virus, de sorte que la valeur Ct indiquant la positivité est d’une importance cruciale. Cette valeur de Ct aurait dû être spécifiée dans la procédure opérationnelle standard (POS) et mise en ligne afin que tous les laboratoires effectuant ce test aient exactement les mêmes conditions limites. Le fait qu’une telle procédure standard n’existe pas est un signe d’une science défectueuse. Les laboratoires sont donc libres d’effectuer le test comme ils le jugent approprié, ce qui entraîne d’énormes variations. Les laboratoires de toute l’Europe sont confrontés à une multitude de questions : quelles amorces commander ? quels nucléotides remplir dans les endroits non définis ? quelle valeur Tm choisir ? Combien de cycles PCR faut-il effectuer ? À quelle valeur Ct l’échantillon est-il positif ? Et quand est-il négatif ? Et combien de gènes faut-il tester ? Faut-il tester tous les gènes, ou seulement les gènes E et RpRd comme indiqué dans le tableau 2 de l’article de Corman-Drosten ? Le gène N devrait-il être également testé ? Et quel est leur contrôle négatif ? Quel est leur contrôle positif ?

Le protocole tel qu’il est décrit est malheureusement très vague et erroné dans sa conception, car on peut aller dans des dizaines de directions différentes. Il ne semble pas y avoir de normalisation ni de procédure opératoire normalisée, de sorte que la manière dont ce test peut être mis en œuvre n’est pas claire.

7. Conséquences des erreurs décrites aux points 1 à 5 : résultats faussement positifs.

Le test RT-PCR décrit dans le document de Corman-Drosten contient tellement d’erreurs de conception en biologie moléculaire (voir 1-5) qu’il n’est pas possible d’obtenir des résultats non équivoques. Il est inévitable que ce test génère un nombre énorme de « faux positifs ». La définition des faux positifs est un échantillon négatif, qui obtient initialement un résultat positif, mais qui est négatif après avoir été testé à nouveau avec le même test. Les faux positifs sont des résultats de tests positifs erronés, c’est-à-dire des échantillons négatifs qui sont testés positifs. Et c’est bien ce que l’on trouve dans le document de Corman-Drosten. À la page 6 du PDF du manuscrit, les auteurs démontrent que même dans des conditions de laboratoire bien contrôlées, ce test génère un pourcentage considérable de faux positifs :

« Dans quatre réactions de test individuelles, une faible réactivité initiale a été observée, mais elle était négative lors d’un nouveau test avec le même test. Ces signaux n’étaient associés à aucun virus particulier, et pour chaque virus avec lequel une réactivité initiale positive s’est produite, il y avait d’autres échantillons qui contenaient le même virus à une concentration plus élevée mais qui n’ont pas été testés positifs. Compte tenu des résultats de la qualification technique approfondie décrite ci-dessus, il a été conclu que cette réactivité initiale n’était pas due à l’instabilité chimique des sondes PCR en temps réel et très probablement à des problèmes de manipulation causés par l’introduction rapide de nouveaux tests de diagnostic et de contrôles au cours de cette étude d’évaluation ». [1]

La première phrase de cet extrait est la preuve évidente que le test PCR décrit dans le document de Corman-Drosten génère des faux positifs. Même dans les conditions bien contrôlées du laboratoire ultramoderne de la Charité, 4 des 310 tests primaires sont des faux positifs par définition. Quatre échantillons négatifs ont d’abord été testés positifs, puis se sont révélés négatifs lors d’un nouveau test. C’est l’exemple classique d’un faux positif. Dans ce cas, les auteurs ne les identifient pas comme des faux positifs, ce qui est intellectuellement malhonnête.

Une autre observation révélatrice dans l’extrait ci-dessus est que les auteurs expliquent les faux positifs comme « des problèmes de gestion causés par l’introduction rapide de nouveaux tests de diagnostic ». Imaginez les laboratoires qui doivent introduire le test sans toutes les informations nécessaires normalement décrites dans une procédure opératoire normalisée.

8. Le document de Corman-Drosten n’a pas fait l’objet d’un examen par les pairs

Avant leur publication officielle dans une revue spécialisée, les articles scientifiques et médicaux sont traditionnellement certifiés par un « examen par les pairs ». Dans ce processus, les rédacteurs de la revue prennent l’avis de divers experts (« referees ») qui ont évalué l’article et peuvent identifier des faiblesses dans ses hypothèses, méthodes et conclusions. En règle générale, une revue ne publie un article que lorsque les rédacteurs sont convaincus que les auteurs ont répondu aux préoccupations des arbitres et que les données présentées soutiennent les conclusions tirées dans le document ». Ce processus est également décrit pour Eurosurveillance [16].

L’article de Corman-Drosten a été soumis à Eurosurveillance le 21 janvier 2020 et accepté pour publication le 22 janvier 2020. Le 23 janvier 2020, le document était en ligne. Le 13 janvier 2020, la version 1-0 du protocole a été publiée sur le site officiel de l’OMS [17], mise à jour le 17 janvier 2020 en tant que version 2-1 [18], avant même que le document Corman-Drosten ne soit publié le 23 janvier à Eurosurveillance.

Normalement, l’examen par les pairs est un processus qui prend du temps puisqu’au moins deux experts du domaine doivent lire et commenter de manière critique le document soumis. À notre avis, ce document n’a pas fait l’objet d’une évaluation par les pairs. Vingt-quatre heures ne sont tout simplement pas suffisantes pour effectuer un examen approfondi par les pairs. Notre conclusion est étayée par le fait que nous avons découvert un nombre considérable de défauts de conception très graves, qui rendent le test PCR totalement inadapté en tant qu’outil de diagnostic pour identifier le virus du SRAS-CoV-2. Tout biologiste moléculaire connaissant la conception de la RT-PCR aurait facilement observé les graves erreurs présentes dans le document de Corman-Drosten avant le processus d’examen proprement dit.Nous avons demandé à Eurosurveillance le 26 octobre 2020 de nous envoyer une copie du rapport de l’examen par les pairs. À ce jour, nous n’avons pas reçu ce rapport et, dans une lettre datée du 18 novembre 2020, l’ECDC, en tant qu’hôte d’Eurosurveillance, a refusé de donner accès à ce document sans fournir de raisons scientifiques substantielles pour justifier sa décision. Au contraire, ils écrivent que « la divulgation porterait atteinte à l’objectif des enquêtes scientifiques ». [24].

9. Les auteurs en tant que rédacteurs

Un dernier point est une préoccupation majeure. Il s’avère que deux auteurs de l’article de Corman-Drosten, Christian Drosten et Chantal Reusken, sont également membres du comité de rédaction de cette revue [19]. Il existe donc un grave conflit d’intérêts qui renforce les soupçons selon lesquels l’article n’a pas fait l’objet d’un examen par les pairs. Il semble que la publication rapide ait été possible simplement parce que les auteurs faisaient également partie du comité de rédaction d’Eurosurveillance. Cette pratique est classée comme compromettant l’intégrité scientifique.

CATALOGUE RÉCAPITULATIF DES ERREURS RELEVÉES DANS LE DOCUMENT

Le document de Corman-Drosten contient les erreurs spécifiques suivantes :

1. Il n’existe aucune raison précise d’utiliser ces concentrations extrêmement élevées d’amorces dans ce protocole. Les concentrations décrites entraînent une augmentation des liaisons non spécifiques et des amplifications des produits PCR, ce qui rend le test inadapté en tant qu’outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SRAS-CoV-2.

2. Six positions d’oscillation non spécifiées introduiront une énorme variabilité dans la mise en oeuvre de ce test en laboratoire dans le monde réel ; la description non spécifique déroutante du document de Corman-Drosten ne convient pas comme protocole opérationnel standard, ce qui rend le test inapproprié comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV-2.

3. Le test ne peut pas faire la distinction entre le virus entier et les fragments viraux. Par conséquent, le test ne peut pas être utilisé pour diagnostiquer des virus intacts (infectieux), ce qui le rend inadapté comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du CoV-2 du SRAS et faire des déductions sur la présence d’une infection.

4. Une différence de 10° C par rapport à la température de recuit Tm pour la paire d’amorces1 (RdRp_SARSr_F et RdRp_SARSr_R) rend également le test inapte à servir d’outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV-2.

5. Une erreur grave est l’omission d’une valeur de Ct à laquelle un échantillon est considéré comme positif et négatif. Cette valeur Ct n’est pas non plus présente dans les soumissions de suivi, ce qui rend le test inapte à servir d’outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du CoV-2 du SRAS.

6. Les produits de la PCR n’ont pas été validés au niveau moléculaire. Ce fait rend le protocole invalide en tant qu’outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV-2.

7. Le test PCR ne contient ni un témoin positif unique pour évaluer sa spécificité pour le CoV-2-SARS, ni un témoin négatif pour exclure la présence d’autres coronavirus, ce qui le rend invalide comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du CoV-2-SARS.

8. La conception du test dans le document de Corman-Drosten est si vague et imparfaite qu’on peut aller dans des dizaines de directions différentes ; rien n’est normalisé et il n’y a pas de procédure opératoire normalisée. Cela remet fortement en question la validité scientifique du test et le rend inadapté comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SRAS-CoV-2.

9. Il est fort probable que l’article de Corman-Drosten n’ait pas fait l’objet d’un examen par les pairs, ce qui rend le test inapte à servir d’outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV2.

10. Nous constatons de graves conflits d’intérêts pour au moins quatre auteurs, outre le fait que deux des auteurs de l’article de Corman-Drosten (Christian Drosten et Chantal Reusken) sont membres du comité de rédaction d’Eurosurveillance. Un conflit d’intérêt a été ajouté le 29 juillet 2020 (Olfert Landt est PDG de TIB-Molbiol ; Marco Kaiser est chercheur senior au GenExpress et est conseiller scientifique de TIB-Molbiol), qui n’était pas déclaré dans la version originale (et qui manque toujours dans la version PubMed) ; TIB-Molbiol est la société qui a été « la première » à produire des kits PCR (Light Mix) basés sur le protocole publié dans le manuscrit de Corman-Drosten, et selon leurs propres termes, ils ont distribué ces kits de test PCR avant même que la publication ne soit soumise [20] ; de plus, Victor Corman & Christian Drosten ont omis de mentionner leur deuxième affiliation : le laboratoire de test commercial « Labor Berlin ». Tous deux sont responsables du diagnostic des virus dans ce laboratoire [21] et la société opère dans le domaine des tests PCR en temps réel.

À la lumière de notre réexamen du protocole de test pour identifier le CoV-2 du SRAS décrit dans le document de Corman-Drosten, nous avons identifié des erreurs et des failles inhérentes qui rendent le test PCR du CoV-2 du SRAS invalide.

CONCLUSION

La décision de savoir quels protocoles d’essai sont publiés et mis à la disposition du grand public est carrément entre les mains d’Eurosurveillance. La décision de reconnaître les erreurs apparentes dans le document de Corman-Drosten a l’avantage de réduire considérablement le coût humain et les souffrances à l’avenir.

N’est-il pas dans l’intérêt d’Eurosurveillance de retirer ce document ? Notre conclusion est claire. Face à tous les énormes défauts et erreurs de conception du protocole PCR décrits ici, nous concluons : Il ne reste pas beaucoup de choix à faire dans le cadre de l’intégrité et de la responsabilité scientifiques.

RÉFÉRENCES

1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Détection de 2019 nouveaux coronavirus (2019-nCoV) par RT-PCR en temps réel. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

2] Communication par courrier électronique entre le Dr Peter Borger et le Dr Adam Meijer : matériel supplémentaire

3] Jafaar et al, Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction-Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, 21 janvier 2020 : https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836 ;

Archives : https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics – COVID19-décès dans le monde : https://bit.ly/3fndemJ

Archives : https://archive.is/PpqEE

6] Essais en laboratoire pour le Centre technique d’intervention d’urgence COVID-19, NIVD, dans le cadre de la

China CDC 15 mars 2020 : http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Manuel PCR en temps réel – Technologies du vivant : https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-

manuel.pdf

Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Guide de bonnes pratiques pour l’application de la PCR quantitative (qPCR) Première édition 2013

[8] Trestan Pillonel et al, Lettre à l’éditeur : Détection du SARS-CoV-2 par RT-PCR en temps réel : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Kurkela, Satu et David WG Brown. « Techniques de diagnostic moléculaire ». Médecine 38.10

(2009) : 535-540.

10] Wolfel et al, Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[11] Outil Web de réduction de l’amorce Thermofischer : https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

Matériel complémentaire

[12] Primer-BLAST, NCBI – Centre national d’information sur les biotechnologies : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et autres (2003) Science. Le site

Séquence du génome du coronavirus associé au SRAS. Science 300(5624) : 1399-1404.

14] Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère, isolat Wuhan-Hu-1, complet

génome : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Borger P. Un coronavirus de type SRAS était attendu mais rien n’a été fait pour être préparé. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf

https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-

comme_le_coronavirus_était_attendu_mais_rien_n’était_fait_pour_être_préparé ;

Archives : https://archive.is/i76Hu

16] Processus d’évaluation et de révision du document Eurosurveillance : https://www.eurosurveillance.org/evaluation

17] Recommandation officielle du protocole Corman-Drosten et manuscrit de l’OMS, publiée le 13 janvier 2020 dans la version 1.0 du document :

https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-

v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf; archive: https://bit.ly/3m3jXVH

18] Recommandation officielle de l’OMS pour le protocole Corman / Drosten RT-qPCR, qui

découle directement de la publication Eurosurveillance, version 2-1, publiée le

17 janvier 2020 : https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-

1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2

[19] Comité de rédaction d’Eurosurveillance, 2020 : https://www.eurosurveillance.org/upload/site-

assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf;

Archives : https://bit.ly/2TqXBjX

20] Mode d’emploi du LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche

Molecular Solutions, 11 janvier 2020 : https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-

gene_V200204_09164154001 (1).pdf

Archive, horodatage – 11 janvier 2020 : https://archive.is/Vulo5 ;

Archives : https://bit.ly/3fm9bXH

Christian Drosten & Victor Corman, responsables des diagnostics viraux au Labor Berlin :

Archives : https://archive.is/CDEUG

22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Cultures virales pour COVID-

19 évaluation de l’infectivité. Examen systématique. Examen systématique doi :

https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

Kim et al, The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome :

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

24] Réponse de l’ECDC au Dr Peter Borger, 18 novembre 2020 :

Matériel supplémentaire

Ulrike Kämmerer et son équipe, étude et tableau Primer-BLAST :

Matériel complémentaire

Documentation complémentaire :

Description RT-PCR RKI Allemagne, à la page 10 de ce lien :

https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE

DownloadsJ/JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf?__blob=publicationFile

Auteurs :

1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Génétique moléculaire, Associé de recherche W+W, Lörrach, Allemagne

2) Rajesh Kumar Malhotra (Alias Bobby Rajesh Malhotra), Ancien artiste 3D / Visualisations scientifiques au CeMM – Centre de médecine moléculaire de l’Académie autrichienne des sciences (2019-2020), Université des arts appliqués – Département des arts numériques Vienne, Autriche

3) Dr. Michael Yeadon BSs(Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacologie U Surrey. Directeur général, Yeadon Consulting Ltd, anciennement Chief Scientist de Pfizer, Royaume-Uni

4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Royaume-Uni

5) Kevin McKernan, BS Emory University, directeur scientifique, fondateur de Medical Genomics, a conçu le pipeline de séquençage à WIBR/MIT pour le projet du génome humain, a inventé et développé le séquenceur SOLiD, a accordé des brevets liés à la PCR, à l’isolation et au séquençage de l’ADN, USA

6) Prof. Dr. Klaus Steger, Département d’urologie, d’urologie et d’andrologie pédiatrique, Andrologie moléculaire, Centre de recherche biomédicale de l’Université Justus Liebig, Giessen, Allemagne

7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), biochimiste et pharmacologue industriel, Loerrach, Allemagne

8) Dr. Lidiya Angelova, MSc en biologie, PhD en microbiologie, ancienne chercheuse à l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (NIAID), Maryland, USA

9) Dr. Fabio Franchi, ancien directeur médical (M.D) d’un service d’infectiologie, spécialisé dans les « maladies infectieuses » et l' »hygiène et la médecine préventive », Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Italie

10) Dr. med. Thomas Binder, Interniste et cardiologue (FMH), Suisse

11) Henrik Ullrich, spécialiste en radiologie diagnostique, médecin-chef au Centre de radiologie de l’hôpital Collm Oschatz, Allemagne

12) Makoto Ohashi, professeur émérite, docteur en microbiologie et immunologie, Université de Tokushima, Japon

13) Dr. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., Microbiologiste, Nutritionniste, Italie

14) Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), spécialiste en médecine de laboratoire (chimie clinique), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Pays-Bas

15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD Chimie et toxicologie de l’environnement. DGI Consulting Services, Oslo, Norvège

16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Département de radio-oncologie, Hôpital Leopoldina de Schweinfurt, Allemagne

17) Dr. Ruth Schruefer, PhD, génétique humaine / immunologie, Munich, Allemagne,

18) Dra. Berber W. Pieksma, médecin généraliste, Pays-Bas

19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), neurologue consultant, Pays-Bas

20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (Biologiste moléculaire), spécialiste de la propriété intellectuelle, BDC Bâle, Suisse

21) Dr. Kevin P. Corbett, MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Sciences sociales (études scientifiques et technologiques) Londres, Angleterre, Royaume-Uni

22) Prof. Dr. Ulrike Kämmerer, spécialiste en virologie / immunologie / biologie humaine / biologie cellulaire, Hôpital universitaire de Würzburg, Allemagne

Contributions de l’auteur :

PB : A planifié et réalisé les analyses et les recherches, en conceptualisant le manuscrit.

BRM : A planifié et mené la recherche, en conceptualisant les figures et le manuscrit.

MY : Correction des analyses et des recherches.

KMcK : A effectué les analyses et les recherches, a conceptualisé le manuscrit.

KS : A effectué les analyses et les recherches.

PMcS : Relecture des analyses et des recherches.

LA : Correction des analyses et des recherches.

FF : Correction des analyses et des recherches.

TB : Correction des analyses et des recherches.

HU : relecture des analyses et des recherches.

MO : Correction des analyses et des recherches.

SS : relecture des analyses et des recherches.

MDvK : Correction des analyses et des recherches.

DG : Correction des analyses et des recherches.

RJK : relecture des analyses et des recherches.

RS : Correction des analyses et des recherches, et du manuscrit.

BWK : Correction des analyses et des recherches.

RvV : Correction des analyses et des recherches.

JB : Correction des analyses et des recherches.

KC : Correction des analyses et des recherches.

UK : Planification et réalisation des analyses et des recherches, conceptualisation du manuscrit.

Lecteurs d’épreuves supplémentaires :

Saji N Hameed, Informatique environnementale, Université d’Aizu, Tsuruga, Ikki-machi, Aizuwakamatsu-shi, Fukushima, Japon

Howard R. Steen, MA Chem. Ing. Cantab, ancien directeur de recherche, Allemagne

Addendum

Mise à jour 2.12.2020 :

La contribution de l’auteur Dr. Michael Yeadon a été modifiée en : Révision des analyses et des recherches.

L’affiliation de l’auteur Kevin Mckernan a été modifiée en : Révision des analyses et des recherches :

Génomique médicinale.

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